本群一直在关心和思辨结构生物的历史和现在和未来，也在自由的讨论各种思维各种技术各种实验细节，和思辨结构生物学中的具体的细节问题，层层递进的讨论。我每次静悄悄的看着群友的发言，学习到了很多。本次整理的是一个专题的后续，如何获得蛋白质和DNA复合物的晶体和结构的获得，我用获得这个词，而不用测定。在浩瀚的自然和科学探索中，我懂的很少，我永远只是个学生，所以在整理的同时，我也在默默的学习。本群都是自由发言，自由讨论，自由思辨，但是都是最深入的前沿问题，各种细节的思辨和升华。都是群友的发言，我只是简单的编辑了一下，希望对广大的结构生物学爱好者涉及到类似的课题有一定的帮助。
王总：前面大家讨论的很热烈的蛋白和DNA复合物的问题，这个其实很常见。我谈谈我的看法，抛砖引玉，大家也看看公司和学校研究的不同。和核酸结合的蛋白，很容易沉淀的，为什么？我们做很多这类蛋白，这个很常见！形成蛋白复合物的蛋白，单个制备的时候，很容易沉淀的，为什么？我们一般认为前者是因为离子相互作用，核酸电荷很强，和蛋白多是电荷相互作用；没有DNA的情况下，这些大面积的电荷容易相互作用，盐融盐析效果明显。复合物中的蛋白，多是通过输水接触面，再加特异性的相互作用结合。尤其是大面积的输水面暴露，很容易相互作用（输水）沉淀。这两类蛋白的解决方式，通用的就是高盐！和核酸相互作用的蛋白，制备复合物中的单体蛋白，常规的需要在1M的盐以上，我们做过1.5或者2M的盐浓度。下一个问题：多高的盐浓度才合适？或者换一个问题：您的蛋白质，对盐的稳定性是多少？大家都知道蛋白质的稳定性，默认的意义是对热的问稳定性。nanoDSF，thermofulour等等测定的都是这个Tm值。蛋白对detergent的稳定性，蛋白对盐的稳定性，蛋白对DMSO的稳定性，蛋白在各种条件下比如储存的稳定性，这些都很重要的。然后，如何测定？我怎么知道这个蛋白多多高浓度的盐是稳定的，多高浓度下就不稳定了？这个测定其实也很简单，把蛋白aliquot到10个小管，从2MNaCl，降低到0.1,0MNaCl，放在30度2hr，测测每个管子剩下的蛋白量。2M剩下的最多，定义为%，0M的可能就是0，看看多少浓度下还有50%，那个盐浓度，就是这个蛋白对NaCl浓度的稳定性（T1/2NaCl）。这个盐浓度，和蛋白量变化的那个曲线（有多陡峭，对数值的峰有多sharp），反应的就是蛋白质对盐稳定性的性质。和nanoDSF的性质类似。周同学：王老师，其实这个盐对不同蛋白的作用不一样吧？有些蛋白不需要盐也可以降解底物（不考虑Tm），但是有些蛋白离开了盐就没有活性了。王总：在说到怎么处理这类蛋白和DNA复合物的制备，请注意这个矛盾：高盐蛋白才稳定，但是DNA是无法结合的；低盐蛋白又不稳定，对吧？请注意蛋白低盐不稳定的原因：离子相互作用，其实有DNA的情况下，复合物实在低盐下稳定的。这就是trick的地方。zijun：如果高盐下mix,再慢慢稀释到低盐，有无帮助？
王总：哈，zijun你也在哈！
王总：yes，bingo！
zijun：这个问题经常碰到的。
王总：想通了这个原因，做法也很简单：蛋白，高盐，+DNA；透析就好。周同学：好的，我对核酸这一块结晶不了解（我们一般是酶和底物共结晶）王总：上面讲的还只是蛋白核酸复合物的第一个问题：样品制备，也就是复合物的形成。第二个问题：蛋白核酸相互作用的特异性！
zijun：上课了，上课了。
冯同学：点赞！
王总：很多复合物结构看不到核酸，其中一个原因是蛋白对核酸序列的特异性不够。前面的例子Kd是0.1uM级别这个还要看核酸多大，蛋白对多个不同的核酸序列是不是都能够在1-0.1M的级别。如果是，那么恭喜你，你碰到第二个问题了，蛋白可以在核酸上滑动，识别有序列特异性，但特异性并不强！核酸各种酶，或者和核酸相互作用的蛋白，天然就需要在核酸上移动，这是生物学必须的。在结晶上的后果就是空间在、核酸看不见（可能是平均掉了）。一般情况下，蛋白和小分子，蛋白和核酸的ratio，是有kd值决定的；蛋白在核酸上的滑动，意味着需要更高的核酸/蛋白的ratio，才能强迫他们形成尽可能稳定均一的复合物，这个是需要考虑的。另外一种考虑方案，就是一定要找更强结合的核酸。
刘同学：请问慢慢稀释有什么好办法吗？是冷库磁力搅拌下逐滴滴入低盐buffer，再超滤管浓缩吗？
王总：如果这个蛋白性质识别本身的特异性就不强，可以加一个domain，可以设计蛋白序列，或者想其他的方法，比如结晶不行，可以试试电镜。可以试试，但不是好方法——核酸的浓度也稀释了。另外一个因素，做复合物的时候，估计很少人考虑：有些样品，在特定的浓度下才更有利于形成复合物，太高或者太低的浓度（尤其是太低）很不利。透析和超滤，不改变蛋白浓度，只稀释NaCl，这个方案相对更好。解决了特异性的问题，还有第三个常见的问题在等着你：核酸的长度。对于结晶来说，核酸太长太短都不太好，怎么知道那个长度刚刚好合适？如果晶体分辨率不够，我们是否能够优化核酸长度提高分辨率？
刘同学：谢谢！zijun：高了也容易沉淀，另外温度也很重要。
王总：我们一般会花比较多的时间研究样品性质，nanoDSF或者thermofluor能够对部分蛋白核酸复合物有用，用于筛选核酸长度。我们也发现，这个方法，对大多数样品无效，所以这个需要大家那自己的样品去做。但我们基本是这个环节多花力气，事半功倍。第四个进入结晶：样品够，有时间也有钱的话，结晶本身就是很重要的研究样品的方法，可以把蛋白和不同序列、不同长度的核酸，都平行做结晶筛选，这个结果可以告诉我们很多线索。就像前面已经提到的，一般都是先筛低盐、专用于这类复合物的kit。其实筛蛋白复合物、筛抗体的kit，有条件的情况下也筛上。蛋白与核酸复合物，是结构生物学，以及药物研发非常重要的“战略发展方向”，欢迎大家各抒己见哈，我们也在学习整理中。zijun：我有次筛了快二十块板左右，只在其中一个孔出晶王总：前面还提到表达的问题，20%的细胞活性。我已经不直接参与细胞状态很长时间了，但我们每周做几百个批次的蛋白表达，超过一半是昆虫细胞，我的印象中都需要80%以上收细胞，没有听说能到50%以下更不要说是20%收细胞了。zijun：核酸长度非常tricky,有什么好的方法，似乎只能不同长度的都去试zijun：分泌表达时如果蛋白或抗体稳定时，可以稍微低些，但20%确实太低了。王总：嗯，我们很少做抗体；那个用的是CHO细胞。
Zijun?王老师：王总：，受益匪浅，想请教您核酸蛋白复合物的专用kit叫什么呢，哪家公司能买到呢？王总：1）nanoDSForthermofluor，有时候Tm会有差异；2）FSEC，测荧光比测灵敏很多，这个可以固定蛋白浓度，不同核酸长度的复合物，看它们在SEC上peak的profile，比如峰宽的的变化；3）CE检测，核酸带电；不同长度核酸的复合物出峰的位置不一致，看相关性看是否在一条内标直线（拿复合物跑核酸电泳也是同样的原理，但一般灵敏度不够）；4）挑3个试剂盒，筛晶体，不出晶体的话看沉淀率的差别（需要用较高的浓度，如果都是澄清的就没用了）；5）欢迎大家补充。。。Zijun?王总：这是我们第一轮筛选蛋白核酸复合物的kit，仅供参考哈！王老师：嗯嗯好滴，感谢～范同学：想插嘴问一下，我重复别人条件，但是文献没有说测浓方法。因为蛋白比较小没有什么吸光度，所以我考虑不紫外测定。那我用bradford或者BCA都可以吗？刘老师：总结的很好，我之前有个转录因子与复合物结构就是通过高盐稳定蛋白，随后加入低盐的DNA，最终在低盐下获得稳定复合物zijun：谢谢。个人经验是筛晶体前一定要确认好蛋白和核酸的结合及复合物的稳定性，我一般会看下分子筛的co-elution结果王总：非常认同啊：筛晶体前一定要确认好蛋白和核酸的结合及复合物的稳定性！分子筛的结果，一定要非常细心的设计实验，保证上样蛋白浓度（测不准）、上样体积一致，数据能够做归一化最好。编者按：独立批判思维在科研中是必不可少的。两篇文章集成的是群里头关于如何获得蛋白质和DNA的复合物晶体结构的讨论。实践出真知。希望我集成编辑的对大家的科研有一定的帮助，那就是不忘初心方得始终。
结构范欢迎阅读