蛋白桑国外蚕业科学应用技术研究进展 [复制链接]

摘　要　进入21世纪,蚕业科学技术的研究在基础研究成果的支持下有较快的发展。尤其是利用蚕丝和桑叶的功能,在医药卫生及其他领域的应用研究,展现出新的前景。简述了近几年来以日本为主的蚕业科学应用技术研究的重要进展。关键词　蚕业;应用技术;家蚕品种;养蚕技术;桑品种;综合利用;蚕生物反应器进入21世纪,蚕业科学技术研究在基础研究成果支撑下有较快的发展。从全世界看,除了中国之外,仍是日本在蚕业科学技术方面开展了多方面的研究,取得了许多重要的成果。世界蚕丝主产国印度、巴西在蚕业应用技术方面主要依靠引进日本的技术。韩国的养蚕业虽然萎缩,但仍积极开展蚕业科学研究,尤其是在蚕、桑综合利用方面取得重大成果。本文简述近几年来以日本为主的蚕业科学应用技术研究重要进展。

1　家蚕品种选育近10年来,日本育成的家蚕新品种主要是不同用途的特征性蚕品种,目的是为生产高附加值、多样化的蚕丝提供具有特异茧丝质性状的原料茧。同时,为了构筑21世纪新的蚕丝业,还进行了能够在医疗、工业领域应用的蚕品种选育。最近育成推广的细纤度蚕品种有改良新曙光(2.44dtex)、白银(1.78dtex)、N7NONF×中(黄茧,2.44dtex)、N7NONF×尼(白茧,2.33dtex)等;粗纤度、多丝量蚕品种有FNG20×N(4.44dtex以上)等。据报道,细纤度蚕品种选育用的原始亲本“MK”的茧丝长m、纤度1.44dtex;粗纤度蚕品种选育用的原始亲本“27粗”的茧丝纤度5.56～6.67dtex。山本等用白银和显性三眠蚕交配获得三眠蚕品种,用激素可从该品种诱导出高比例的二眠蚕,茧丝纤度0.56dtex。近几年日本育成多个有色茧家蚕品种,如黄茧品种“钟光×黄玉”推广使用较多。具有类黄酮色　　蚕　业　科　学;33(4)　素的绿茧品种“PNG×PCG”、“彩色”在部分地区推广。导入“琉球”多蚕茧品种血缘再进行改良,育成同宫茧率30%的N玉、C玉2个品种,在特制的蔟上结茧,同宫茧达80%,以缫制双宫丝。作为资源保存的蚕品种绵蚕的丝也已用来纺织丝绸,制作外衣息,通过图位克隆(mapbasescloning)获得蚕对BmDNV感染性和抵抗性基因(nsd2)。感染性蚕品种的该基因含有14个外显子,全长18kb。感染性蚕品种之间在第7内含子中有差异,但不影响表达。抵抗性蚕品种中,该基因第5-13外显子缺失(约6kb),因而不能正常翻译。进一步研究表明,该基因的表达产物是具有2处糖基化位点的12次穿膜型膜蛋白质。家蚕浓核病毒对蚕的感染,可能就是通过这种类似受体的蛋白质实现的。该研究已经申请专利。Takahashi等于年首次揭示了黄色茧形成机制。黄色茧的茧色来自桑叶中的类胡萝卜素(carotenoid),黄茧品种的肠道有一种与桑叶中包含的类胡萝卜素结合的蛋白质(CBP),能和类胡萝卜素结合,使类胡萝卜素被摄取进入血液,该蛋白质已经被分离。黄茧蚕品种中CBP基因由5个外显子和4个内含子组成,品种间在第3个内含子区有含或不含反转录转座子系列的差异,但不影响CBP基因表达。白色茧蚕品种其CBP基因的第2外显子缺失,不能表达CBP,并由于桑叶中的类胡萝卜素不能进入血液,因而结白茧。通过转基因技术将CBP基因转入白色茧蚕品种,由于CBP表达功能恢复,因而结出黄茧。最近,利用裸蛹(Nd)做亲本育成每头蚕分泌丝胶70～80mg的蚕品种“丝胶希望(sericinhope)”,再和普通品种杂交,由于Nd是显性,所以杂交种只分泌丝胶。该品种已用于批量生产大分子丝胶蛋白质。

2　家蚕饲养技术2.1　省力化养蚕日本从20世纪60-70年代研制简易饲育装置、条桑割取机、给桑台车,直到年前后已形成适合于目前日本农家养蚕的技术体系。在这漫长的研究过程中,技术指标几度修改、降低。从年最终建立的省力化养蚕技术体系看,以采用机械的高效率桑园管理及条桑收获运送、广食性蚕品种、1～4龄或1～3龄人工饲料育、4～5龄传送带式省力饲育机械装置、熟蚕促进剂自然上蔟及风洞式蔟中保护装置等为主要技术环节。

2.2　人工饲料及原蚕全龄人工饲料育清水等于年研制出用新鲜桑叶制作人工饲料的方法。该方法只用磨碎机将桑叶打碎就可以,不需要加热烘干,营养成分的损失少,制作成本低。原蚕全龄人工饲料育主要内容:原蚕用低成本人工饲料的研制,适应人工饲料的蚕品种选育,适合原蚕生长发育及产卵性的标准饲养技术,蚕种保护处理技术。实施该项技术体系获得了无微粒子病的蚕种,保证了养蚕生产安全用种,而且蚕种生产成本也进一步降低。如:春蚕期饲养“芙1·蓉1”,公斤种茧生产成本日元。饭冢等于年建立了蚕种2年长期保存方法。产卵后经25℃保护60d后,在20、15、10、5℃中分别保存5d,再在0℃经过10d,放入2.5℃冷藏d;然后在5℃保护90d,进行中间感温(10℃,2d;15℃,4d);此后移入0℃再冷藏d。加上卵的催青日数(15d)和幼虫、蛹的经过(40d),从第1世代的孵化到第2世代的孵化恰好是2年。供试的4个杂交种的孵化率为87.6%～90.9%。大沼于年育成暗色斑限性的平衡致死系统“BL”,该系统雌蚕W染色体持有第2染色体的Ml1l2P片段和Z染色体的+、+片段,Z染色体持有+、l2;雄蚕2条Z染色体分别持有l1/+l2、+l1/l2。进一步用暗色斑限性的平衡致死系统“BL”雌和育种材料W7雄杂交,然后反复回交W7雄(或回交W7雌),将平衡致死基因导入W7,获得了致死基因杂合系L1(l1/+l2)、L2(+l1/l2)。再用L1和L2系雄分别与BL系雌交配,获得新的平衡致死系,并继续进行实用性状选择。育成的新BL系雌与实用品种杂交原种(F7·Nt)杂交,组成夏秋蚕用一代杂交种(命名白金仔,platinaboy)。农家饲养成绩:茧层率26%,茧丝长m,茧丝纤度2.54dtex,[8]解舒率74%,全龄经过22d。抗病品种选育仅见于对家蚕浓核病毒(BmDNV)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)抗性方面。如,细纤度蚕品种“朦胧”、多丝量蚕品种“大成”就兼具抗DNV特性。最近,利用家蚕全基因组解读信。　

2.3　无菌养蚕所谓的无菌(germfree)养蚕,其实是限菌动物饲养(gnotobiote)或限菌饲养(gnotobiosis)。设计无菌人工饲料的组成要在充分兼顾蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素、无机盐5大要素平衡的基础上,使饲料中水分含量接近桑叶,且采用蒸气灭菌等措施。人工饲料的标准组成:干燥桑叶粉32%,脱脂大豆粉47%,纤维素12%,氯化胆碱0.2%,VC1.5%,柠檬酸2.0%,谷固醇0.4%,其他微量成分(含VB群)1.5%。1～3龄饲料食下量约占全龄的3%,4龄占7%,5龄占90%。生产上应按养蚕数量分别制作。可采用专门机械将饲料制成平板状或波瓦状,通过蒸煮灭菌制成无菌人工饲料。饲料成本每公斤日元,市售～日元种的钵栽株而育成,是二倍体与四倍体的混数体,果实大、丰产。栽植第2年平均每株收果个、3g。桑果中含花青甙(anthocyanin)具有消除活性氧的作用,作为功能化食品有开发前途。

3　桑品种选育日本的桑树育种目标主要是高产量、高饲料价值、抗病虫害等。1年以后,桑树栽培技术改革,以机械收获为前提的适合于密植栽培的桑品种成为主要目标。同时,随着桑叶作为健康食品应用及桑果在食品上的应用,非饲料用途的桑品种选育也成[1]为新的需求。桑品种选育以适应温暖地区1年多次养蚕、全年优质高产桑叶、适合机械化收获为目标,年育成“夏攀”并通过审定。该品种产叶量高,耐桑缩叶细菌病、里白粉病,对萎缩病中等抗性,饲料价值同新一之,适合小型条桑收割机收获。新育成的果桑品种“拉拉桑”开花年限长,栽植次年就可以收获果实。该品种的果实产量比原亲本大唐桑高30%,最大果实超过15g。果桑品种白利(Brix)果实中含糖分9%～10%,适于制果酱。果桑品种“波朴桑”的果实酸味淡,适于作庭院果树鲜食用,果实大小4～6cm、果重6～7g。果桑“FMR01”由秋水仙碱处理诱导“形新”品　　蚕　业　科　学;33(4)　大量糖分有吸湿作用而使粪便软化,因发酵产生的气体造成大肠蠕动,可改善便秘。

4　桑叶的功能及利用4.1　桑叶乳汁中的活性成分Konno等发现桑叶对蓖麻蚕、夜盗蛾等鳞翅目昆虫有毒性,喂食几天内就死亡。但是,将桑叶切碎,用水洗去白色乳液再喂食,幼虫能良好生长。人工饲料中添加桑叶乳汁,饲喂蓖麻蚕有强的毒性,表现出生长发育被抑制。由此表明桑叶乳汁对某些昆虫具有毒性和抑制生长发育的活性。经分析,桑叶乳汁中含有高浓度的类糖生物碱,包括1,4二脱氧1,4亚氨基D阿拉伯糖醇、1脱氧野尻霉素以及1,4二脱氧1,4亚氨基D核糖醇。这些类糖生物碱在一部分桑树品种中的含量达到乳汁的1.5%～2.5%,干质量的8%～18%。用离子交换树脂柱层析可以纯化这些物质。类糖生物碱在乳汁中的浓度,不同桑品种间有差异。栽培品种“不知雪”、“市平”的桑叶中类糖生物碱浓度高,并且以1,4二脱氧1,4亚氨基D阿拉伯糖醇为主。“一之”只含有低浓度的1脱氧野尻霉素。1,4二脱氧1,4亚氨基D阿拉伯糖醇和1脱氧野尻霉素等类糖生物碱对蓖麻蚕幼虫表现毒性,而对家蚕却完全没有毒性。桑叶乳汁,除含类糖生物碱之外,可能还存在高分子的耐虫因子(毒物)。植物乳汁是植物的耐虫机制之一,这种珍贵的生理活性物质将为农药、医疗或作物耐虫育种应用。桑叶中可提取的类糖生物碱约占干质量的0.1%～0.01%,10mg产品市售价数万日元。

4.2　抑制α葡糖苷酶活性和肠道调节作用已经证实桑叶抽提物对小肠中的消化酶α葡糖苷酶有抑制作用。因此,饮用桑叶抽提物或桑茶,对控制进餐时或餐后的血糖是有效的辅助方法。据调查,桑叶是43种草药中对α葡糖苷酶抑制活性最强的。桑叶中含有的α葡糖苷酶抑制物使原本在小肠被吸收的大量糖分因大肠内细菌的作用发酵,产生许多有机酸,使肠液呈酸性,有害细菌不能发育,乳酸菌、二裂菌(bifidus)的比例增加,从而起到调整肠道微生物的作用。同时,大肠中未吸收的。全龄给饵2次(1龄、4龄各1次,饲养2万头蚕时第1次给饵3.6kg、第2次给饵85kg)或3次(1龄、4龄、5龄各1次)。这种生产方式,可以按计划每日生产目标数量的蚕茧。一般采取鲜茧缫丝,为应对化蛹前来不及缫丝,设计了保存鲜茧1～2个月的方法。低成本人工饲料无菌养蚕的蚕茧和生丝,不易发生黄变,色泽白、光泽好,纤度细,练减率低,染色性好。

4.3　抑制人类免疫缺损病毒(HIV)感染HIV是引起人类免疫功能缺损的病毒。HIV主要感染在细胞免疫系统中起核心作用的CD4阳性淋巴球(辅助T细胞)。桑叶中所含1脱氧野尻霉素,通过对糙面内质网中α葡糖苷酶Ⅰ、Ⅱ的抑制而阻碍糖蛋白的修饰,使复合寡糖的高级结构不能形成,糖蛋白的异常功能表达与分泌受到抑制。gp糖链在HIV感染时起着对CD4受体的吸着、浸透作用。所以,1脱氧野尻霉素对gp糖链生物合成的阻碍就减少了HIV的感染。

4.4　促进胰岛素分泌、降血压、降低胆固醇(预防高血脂)已证实桑叶中的含氮糖类化合物具有促进唾液分泌的作用。唾液中存在促进胰岛素分泌的PC肽因子,胰脏中有PC肽受体。桑叶中的含氮糖类化合物促进唾液分泌血糖调节因子,可能成为新型糖尿病治疗药物。桑叶成分中的γ氨基酪酸(GABA)具有抑制血压的作用。另外还有报道说桑叶有改善脂肪代谢的作用和较强的抑制胆固醇上升的效果。给患高血脂症的实验系兔食下桑叶抽提物,显微镜观察表明,实验兔肝细胞滴状中性脂肪的沉积程度轻,不易形成脂肪肝。用实验大鼠、小鼠测定的结果表明,桑叶抽提物有改善肝功能的效果。主要表现在降低肝脏的中性脂肪,服用2%浓度的桑叶抽提物可将高脂肪肝中的脂肪含量从mg/g降低到mg/g,降低肝脏谷(氨酸)草(酰乙酸)转氨酶(GOT)和谷(氨酸)丙(酮酸)转氨酶(GPT)(自U/L降低到90U/L),胆固醇自68mg/g降低到45mg/g,饲料中添加5%桑叶粉饲喂大鼠,16周后最低血压从19.kPa降低到17.kPa。人体从食物摄取的能量70%来自糖分营养。如前述,桑叶具有阻碍消化吸收糖分的α葡糖苷酶活性的作用。据全日本进行体重变化的调查,健康成人不改变饮食成分,每餐前饮用一定量的桑茶,14d后人中54%的人体重减轻。又据“读卖新闻”(年10月19日)报道,5人参加试验50d,每餐前饮用1颗桑叶茶胶囊,1人体重无变化,4人体重减轻1.4kg。桑叶抽提物本身不诱发染色体异常,是安全性的物质。但桑叶抽提物具有抑制变异原物质(MNNG及过氧化氢)诱发染色体异常的效果,对丝裂霉素C诱发姐妹染色体交换也有抑制效果(30%～70%),并且对乙基甲烷磺酸盐诱发的巯基鸟嘌呤耐性突变也有抑制作用。所以,桑叶提取物对癌症早期的DNA损伤可能有预防作用。

4.5　桑叶复合材料的功效桑叶配合其他食品成分,可提高桑叶原来持有的功能,例如桑叶抽提物中加入蜂胶制成的糖尿病预防食品“桑polis”。蜂胶(propolis)是蜜蜂从树木新芽、蕾、树皮采取的树胶、树液、植物性色素、香油等物,加上蜜蜂本身的分泌液、蜂蜡等混合制成。蜂胶的主要药理作用是:杀菌、提高免疫功能、抑制炎症和接触性皮炎、改善肝功能、保护脑、保护胰脏的β细胞等。“桑polis”用的蜂胶是巴西产蜂胶,采自特定蜜源植物,这种植物具有强的消除自由基活性。在不降低活性的条件下将桑叶抽提物浓缩后,以一定比例与巴西蜂胶混合,既不损害桑叶和蜂胶的各种药理作用,又具有相辅相成的效果。目前“桑polis”已经作为糖尿病预防食品生产并市售。因产品消除了蜂胶原有的刺激性气味和口味,而且没有蜂胶原来的粘性,糖尿病患者可将其添加到自己喜欢的饮料中。经过东京卫生病院等6所医院的临床试验,饮用“桑polis”1～2个月,患者血糖值及糖化血红蛋白(HbA1c)得到改善,胰岛素水平上升,肝功能改善。

5　蚕丝的功能及应用5.1　丝素的功能与利用丝素在非衣料领域应用的研究很活跃。丝素蛋白在化妆品、护髪制品、食品等领域作为原材料已经实用化,主要是利用丝素蛋白质所具有的特性:适度的吸湿、放湿性,富有光泽,吸收紫外线,优良的染色性,活体亲和性等。同时,丝素蛋白质作为面向医药的生物材料研究以及通过化学修饰增加丝素蛋白质新功能的研究报道也很多。丝素溶于高浓度盐溶液,经透析脱盐成为丝素水溶液。水溶液的丝素可以加工成粉末、凝胶、水凝胶、海绵体、膜等形态的材料。由于整个成材过程不使用有害溶媒、交联剂等,是有利于环境保护的无公害、无毒天然材料。Tamada将丝素和丝胶同氯磺酸·吡啶混合物。陆瑞好等:国外蚕业科学应用技术研究进展；反应而硫酸化,制成硫酸化的丝素和丝胶。调查它们对人全血的抗凝血作用,两者都能够延长血凝时间。说明硫酸化的化学修饰给蚕丝蛋白质带来抗凝血活性。另外,还发现硫酸化的丝素能提高被HIV(人免疫缺损病毒)感染细胞的生存率,并且添加多量的硫酸化丝素对正常T细胞完全没有影响。发免受外界因素的伤害,还能够改善头发的光泽与弹性。同时,由于丝胶的保湿性、抗静电性、保型性以及对紫外线的吸收能力,有利于保护头发的健康与美观。Zhaorigetsu等通过小鼠皮肤癌变模式系统的实验证实,丝胶有抑制皮肤癌的效果。在用致癌物二甲基苯丙蒽(DMBA)诱发、用14酰巴豆醇的乙酸盐(TPA)做促进癌变剂的情况下,事前在皮肤的同一位置涂布5.0mg丝胶的小鼠,16周后发生肿瘤的动物数只有对照区的6%,每头动物平均发生肿瘤数只有对照区的1%以下。进一步的检测表明,丝胶涂布小鼠真皮细胞中因TPADMBA处理引起的肿瘤坏死因子TNFα蛋白质的表达被抑制。Sasaki等。糖链与活体内各种分子识别机制密切相关。已经成功地通过化学修饰使丝素附加N乙酰基壳寡糖或乳糖,后者具有与胶原蛋白相同的良好的肝细胞附着性。在增加丝素的骨亲和性、血液亲和性方面也获得初步成效。将具有骨亲和性的含有磷酸基团的2甲基丙烯酰基磷酸(MOEP)单体接枝聚合在丝素中,使接枝聚合后的丝素能很快与磷灰石成分构成复合体,将其埋植在大鼠大腿骨,骨结合性显著增强。现正利用蚕丝的强度、弹性及活体亲和性制作人工腱和韧带。2甲基丙烯酰基氧乙基磷酸胆碱(MPC)与丝素接枝聚合,在接枝聚合率为1%～2%时,接枝聚合的丝素能显著抑制血小板的附着(血小板附着是产生血栓的起因),有希望用作人工血管的材料。由于基因操作技术的发展,已经有可能从基因水平进行蛋白质的分子设计与生产。目前一些实验室正努力进行将家蚕丝和蓖麻蚕丝、蜘蛛丝、粘连蛋白基序、弹性蛋白基序等相组合的新功能蚕丝材料的设计与生产将丝胶以1.5%丝胶+21.5%酪蛋白、3.0%丝胶+20.0%酪蛋白的比例加入饲料喂养小鼠,对照为23.0%酪蛋白。给小鼠注射致癌剂1,2二甲基肼,饲养5周后,调查大肠发生前癌病变指标畸变小囊病灶(ACF)的数量与面积。与对照相比,饲料中含1.5%、3.0%丝胶的小鼠其畸变小囊病灶分别减少20%、40%,表现出显著抑制大肠癌发生的效果。而且,随着饲料中丝胶量的增加,抑制效果更好。据报道,给大鼠喂食含3%丝胶的饲料,大鼠对铁、锌、镁、钙的吸收显著增加(20%～40%)。常用的药物往往增加对某种矿物质的吸收但又抑制另外一种矿物质的吸收。丝胶却能同时促进对多种矿物质的吸收。已知丝胶覆在培养基的表面或涂层,能够促进成纤细胞的增殖。据报道,采用无血清培养基的杂交瘤细胞培养细胞系,培养基中添加丝胶有显著促进细胞增殖的作用,其效果与牛血清白蛋白(BSA)相同。添加丝胶的培养基即使经过高压蒸汽灭菌也表现同样效果。Takahashi等在昆虫培养细胞Sf9的培养基中添加丝胶,可以阻止血清饥饿情况下引起的细胞死亡和激发细胞生长。对照区血清饥饿状态延续5d后的细胞生存率为20%,添加0.3%丝胶的细胞生存率约60%,添加0.3%牛血清白蛋白的细胞生存率约80%。近几年国外许多实验室研究用丝胶处理棉纤维、合成纤维。经过丝胶涂层的纤维(聚酯纤维、尼龙棉纤维等)和织物,因纤维外层被覆丝胶,可以避免化学纤维直接接触皮肤,从而减少化学纤维对。

5.2　丝胶的功能与利用丝胶蛋白质持有羟基的氨基酸含量多,如丝氨酸、苏氨酸共占40%,因此保水、保湿性好。丝胶的氨基酸组成和人类皮肤中的天然保湿因子(NMF)的游离氨基酸组成相似。丝胶蛋白的分子构象主要是无规卷曲,空间结构松散。丝胶多肽链表面有许多亲水基团(—OH,—COOH,—NH,这些亲水基2)团同人体内传至皮肤角质层的水分结合,使皮肤保持适度的水分,防止皮肤干燥、起皱、糙裂。丝胶有较强的抗氧化作用,实验表明,丝胶对亚油酸过氧化的抑制效果相当于牛血清蛋白的80%～90%。最终浓度0.5%或1.0%的丝胶能显著抑制酪氨酸酶活性(分别降低到76%和50%)。丝胶抑制酪氨酸酶活性,也就抑制了黑色素合成系统的活动,减少黑色素积累,起到美白皮肤的作用。丝胶对头发有很好的亲和性。丝胶溶液能够在头发表面形成一层保护性的透明薄膜。不仅保护头　　蚕　业　科　学;33(4)　皮肤的刺激。如用丝胶涂层的聚酯纤维与未经涂层的相比,在40℃、RH90%条件下放置2h,标准吸湿率提高9倍以上。据报道,日本大阪回生病院临床测试丝胶涂层织物作内衣使用的效果表明,使用丝胶涂层织物,接触过敏性皮炎的症状大幅度减轻尿酸也有强的抗氧化能力,也是人类皮肤角质层中天然保湿因子的成分之一。茧层游离氨基酸含有多量天然保湿因子的主要成分。茧层矿物质钙、钾等能促进皮肤角质层细胞代谢旺盛。可以说,淡绿色茧茧层抽提物是理想的化妆品、护肤品原料。

5.3　淡绿色茧茧层抽提物的功能与利用栗罔、山崎等研究发现,淡绿色茧的茧层具有强的消除自由基作用,即抗氧化活性。以大造、淡绿色茧、黄色茧、白色茧分别制备茧层热水抽提物,比较它们的抗氧化活性。大造茧层抽提物的抗氧化活性比白色茧高10倍以上。包括大造在内的淡绿色茧,其茧层抽提物消除二苯基苦基肼(DPPH)自由基的能力和抗过氧化物生成的能力,为常用抗氧化剂维生素E的1倍以上。进一步用70%乙醇从大造茧层抽提物中分离出3′,4′,3,5,7五羟黄酮7OβD葡萄糖苷(约占34.8%)、4′,5,7三羟黄酮醇7OβD葡萄糖苷(约占27.5%)等7种黄酮醇和糖基黄酮醇。这些糖基黄酮醇和桑叶中所含的糖基黄酮醇在化学结构上不同,可能是在家蚕体内合成的。淡绿色茧茧层中的黄绿色成分是类黄酮醇物质。已知类黄酮醇物质是具有多种生理保健功能的重要物质,如:抗氧化、抗肿瘤、降低胆固醇、抑制酶活性等。淡绿色茧茧层中的黄酮醇具有强的抗氧化能力和抑制酪氨酸酶的作用,既保护皮肤避免氧化反应造成的损害,对皮肤还有美白作用。茧层所含,从丝腺和蚕丝得到胶原蛋白前体与丝素L链的融合蛋白。但全长胶原蛋白基因导入蚕,用蚕生产具有特殊功能的胶原蛋白尚未见报道。Yamada等在Ser1基因上游区域插入猫的干扰素基因,通过显微注射获得导入了猫干扰素基因的转基因蚕。猫干扰素基因在中部丝腺表达,检测证实转基因蚕的茧丝具有抗病毒活性。但产量还不够高,有待在启动子方面进行改进。与已知抗菌素作用不同,家蚕和独角仙的抗菌蛋白质是以细菌细胞膜为靶,破坏膜结构物理性质,使膜上开孔而杀死细菌,产生耐性菌的可能性小。利用Ser1基因启动子,以转座子作载体,获得防卫素转基因蚕。检测表明,防卫素在中部丝腺表达,但量尚少,目前正对启动子做改良。此外,还利用丝胶茧突变品种(NdS,只合成丝胶,基本上不合成丝素)作宿主,获得绿色荧光蛋白质(GFP)转基因蚕。从其后代中部丝腺能够分离到GFP。预期这个方法能用于后部丝腺难分泌的胶原蛋白或膜蛋白之类的生产。

6　家蚕生物反应器之一———转基因蚕Tamura等开发了用3XP3启动子作标记基因、在眼和神经系统表达的转基因系统,目的基因EGFP(增强的绿色荧光蛋白质)在胚胎、幼虫单眼、成虫复眼表达。最近,采用不损害原有纤维或织物风格的方法将丝胶涂层或固定在各种纤维表面,能够耐受50次以上洗涤仍保持丝胶涂层。丝胶的5种主要蛋白质都有共同的富含丝氨酸、由38个氨基酸残基组成的特征性重复单位重复12次以上的重复序列区域。辻本设计了由上述38个氨基酸残基序列重复2次组成的76肽密码,依此人工合成76肽基因并在大肠杆菌中表达合成了该76肽。用荧光显微镜可以观察,筛选转基因个体方便。同时,还改进了显微注射蚕卵的方法。在3XP3实验中,注射粒卵,约40%孵化、生长发育为成虫,相互交配得到蛾区次代卵。其中36蛾区(占16%)含有转基因蚕。熟练者每小时注射粒卵,每天可注射粒卵。在GAL4/UAS的实验中,注射粒卵,孵化粒(占26.6%),得到成虫头,次代卵蛾区中有8个阳性蛾区(转基因蛾区),占2.1%。Imamura等利用酵母的转录控制因子GAL4和它的靶序列UAS,据说能够控制转基因蚕中目的基因在各组织或特定组织中表达。如,用A3启动子时可以在全身表达,用3XP3启动子时只在单眼和复眼表达,用fibL链启动子时只在后部丝腺表达等。胶原蛋白由于组织亲和性好,已经用在组织培养和药物施用方面。市售胶原蛋白是从牛皮抽取的,由于担心可能混入能感染人的病原物而引起过敏症之类的问题而受到拒绝,而用微生物、动物表达尚未成功。Tomita等将人胶原蛋白基因部分序列(minicollagen)导入蚕表达成功。调查了精制的该76肽对乳酸脱氢酶(LDH)由冷冻融解而失活的保护作用。LDH对冷冻敏感,在液氮中反复冷冻1min、30℃融解5min,活性显著降低。不添加冷冻保护剂时,5次重复处理,残留活性在10%以下。添加上述丝胶肽,5次重复处理,残留活性在90%以上。可见丝胶肽有佷好的冷冻保护作用,与常用冷冻保护剂牛血清白蛋白相媲美。

7　家蚕生物反应器之二———BmNPV载体蚕表达系统
　　这方面的研究到5年已经基本解决了自重组病毒感染蚕到将蚕体内生产的蛋白质回收为止整个过程中的主要技术,达到实用化的要求。一般经口接种重组病毒NPV,蚕儿几乎不感染。采用多氧菌素(polyoxins)等促进感染药剂,制成含0.5%该药剂的人工饲料喂蚕,经口接种重组病毒就很顺利达到%的蚕感染。经皮接种每分钟50头蚕,每头蚕5μL病毒液,可%感染。已经研制出经皮接种的简易微量注射装置。原来从接种蚕血液收集表达的蛋白质,需要逐头剪开腹足、放出血液。为了提高生物反应器的生产效率,研制出用CO2激光器产生的红外激光沿8～10体节正中线直线切开外皮11～12mm,体液从切口喷出,流入自动收集血液的装置。其后又研制出冷冻融解血液采取法:将接种病毒后4～5d的5龄蚕投入0℃水中,5～7s后蚕体僵直呈棒状,移入20～30℃的乙醇液进行冷冻处理;冷冻的蚕放入缓冲液中,利用冷冻幼虫融解时身体收缩的现象,用激光切开表皮或腹足收集血液;用新研制的分光光度计自动计测系统和软件测定血液回收程度。最近,又研制出多关节机器手代替人工进行被接种蚕的给饵、饲养、血液回收的自动化封闭系统,使生产过程向无公害安全系统跨进一步糖蛋白在N型糖链的结构上不同。糖链具有使糖蛋白与细胞结合等重要生理活性。如果BmNPV蚕系统不能在它生产的蛋白质上附加哺乳类型糖链,其用途就受到很大限制。Mori等同时采用AcNPV、转座子piggyBac和转基因蚕技术,将哺乳动物的β1,4半乳糖苷基转移酶基因插入重组病毒AcNPV,与辅助病毒一起注射蚕卵。获得的转基因蚕血液中表达的目的蛋白质附加了N型乙酰氨基葡糖和半乳糖。这为生产流感病毒膜蛋白之类具有复合型糖链的蛋白质作为疫苗使用带来希望。另外,利用人工合成的保幼激素类似物涂布4龄蚕表皮,获得6龄蚕。6龄起蚕再用保幼激素类似物处理,可连续食饵2周,蚕体大,每头蚕可取血液1.5mL(普通5龄蚕每头取血液0.5mL),期望用于BmNPV蚕表达系统,提高生产效率。采血后的幼虫尸体,用干燥装置和选别装置按丝腺、表皮、残渣分为3份,分别回收。干燥后蚕尸骸质量减少为原来的1/5。1万头蚕可回收表皮1.65kg。羽贺利用取血后的幼虫尸骸收集几丁质。通过化学修饰成为二丁酰基几丁质,在过氯酸存在下以无水酪酸做溶媒将几丁质酯化。二丁酰基几丁质通过油/水乳浊液蒸发溶媒,得到粒径20～50μm、形状大体均匀的微细粒子(microshere)。根据几丁质的生物降解性带来的缓释效果,成功应用于药物缓释系统,如支气管扩张剂茶碱(1,3二甲基黄嘌呤)。将茶碱与二丁酰基几丁质混合,制成球形微细粒子。粒子直径越小、药物释放越快,在中性条件下使用效果好。经改进后的“BmNPV载体蚕表达系统”包括重组病毒载体构建、专用蚕品种选定(如NLS1×CLS1)、人工饲料配制、饲育法与饲育装置、病毒接种法、血液采取法及装置、目的蛋白质回收与纯化、重组病毒的灭活与封藏、废弃物处理与利用等。在日本已可以委托片仓株式会社利用该系统(superworm,超虫)进行目的蛋白质的生产。年日本用“BmNPV载体蚕表达系统”生产的猫干扰素(intercat)产值13亿日元。5年,针对狗皮肤病发生最多的接触过敏性皮炎的治疗药物“狗干扰素(interdog)”也已商品化。最近,大浦等建立了可以一次饲养2万头5龄蚕规模、由微机管理的全自动无人饲育体系,包括饲养环境调节、生长发育和行为观测、给饵、蚕的回收等全部实行自动化和微机管理。最大的好处是能够防止外界微生物(杂菌、病毒等)进入饲育室。哺乳动物细胞合成的糖蛋白与昆虫细胞制造的。

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